Секвенирование стало краеугольным камнем современной геномики, позволяя ученым «читать» генетический код. Эта технология открыла путь к персонализированной медицине, изучению эволюции и пониманию молекулярных основ заболеваний. Мы расскажем про этот процесс, как он работает, методах и истории развития.
Главное о секвенировании
- Секвенирование — метод «чтения» ДНК, позволяющий определить последовательность нуклеотидов и понять, как устроен генетический код.
- Он используется для диагностики наследственных болезней, подбора терапии, изучения эволюции и судебной экспертизы.
- Включает выделение ДНК, ее фрагментацию, считывание последовательностей и сбор данных с помощью биоинформатики.
- Методы ― от классического метода Сэнгера до высокопроизводительных (NGS) и технологий третьего поколения, способных анализировать отдельные молекулы.
Что такое секвенирование
Секвенирование — это определение точного порядка нуклеотидов (аденина, тимина, гуанина и цитозина, обозначаемых как A, T, G, C) в цепи ДНК или РНК. Если представить геном в виде книги, то секвенирование позволяет прочесть каждое слово, не пропустив ни одной буквы.
Эта процедура является фундаментальной для решения множества задач:
- выявления генетических вариаций, связанных с наследственными заболеваниями;
- идентификации возбудителей инфекционных болезней;
- изучения мутаций в раковых клетках для подбора целевой терапии;
- установления родственных связей и изучение эволюции видов;
- криминалистической экспертизы.
Таким образом, секвенирование — это мощный инструмент, находящий применение в самых разных сферах человеческой деятельности.
Как происходит секвенирование ДНК
Несмотря на разнообразие современных методов, общий принцип того, как происходит секвенирование, остается неизменным. Его можно разделить на несколько ключевых этапов.
1. Выделение и подготовка ДНК
Первым шагом является получение чистой молекулярной матрицы. ДНК извлекают из клеток образца (крови, ткани, слюны), очищают от белков и других примесей.
2. Фрагментация
Поскольку целые хромосомы слишком велики для анализа, их произвольно разбивают на множество коротких фрагментов.
3. Библиотека подготовки
К концам этих фрагментов присоединяют специальные адаптерные последовательности, которые позволяют им в дальнейшем связываться с носителем для анализа.
4. Секвенирование
Фрагменты из библиотеки считываются с помощью одного из выбранных методов (например, синтеза комплементарной цепи). В ходе этой реакции генерируются сигналы, которые фиксируются детектором.
5. Биоинформатический анализ
Полученные «прочтения» (короткие последовательности) с помощью мощных компьютеров и специальных алгоритмов собираются в единую длинную последовательность — реконструированный геном.
Методы секвенирования ДНК
Технологии секвенирования постоянно развиваются. Можно выделить три основных поколения этих методов, каждое из которых знаменовало собой значительный скачок в скорости, стоимости и объеме данных.
Метод Сэнгера (Первое поколение)
Этот метод, разработанный в 1970-х годах Фредериком Сэнгером, долгое время был «золотым стандартом». Он основан на избирательном включении в растущую цепь ДНК дидезоксинуклеотидов (ddNTP), которые прерывают синтез. Каждый тип ddNTP (A, T, G, C) помечен флуоресцентным красителем. В результате получается набор фрагментов разной длины, которые разделяются капиллярным электрофорезом. По детектируемому сигналу определяется последовательность.
- Плюсы метода: высокая точность, длинные прочтения.
- Минусы метода: низкая пропускная способность, высокая стоимость на большой объем данных.
Высокопроизводительное секвенирование (NGS, Второе поколение)
Эти технологии и методы, появившиеся в 2000-х годах, позволили параллельно секвенировать миллионы фрагментов, что резко снизило стоимость и ускорило процесс. К ним относятся платформы от компаний Illumina (технология секвенирования путем синтеза), Ion Torrent (детекция выделения иона водорода) и другие.
- Плюсы: чрезвычайно высокая пропускная способность, низкая стоимость за мегабазу данных.
- Минусы: короткая длина прочтений, что усложняет сборку сложных участков генома.
Секвенирование третьего поколения
Новейшие методы, такие как SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) от PacBio и нанопоровое секвенирование от Oxford Nanopore, позволяют считывать последовательность единичных молекул ДНК в реальном времени без предварительной амплификации.
- Плюсы: очень длинные прочтения, что упрощает сборку и выявление сложных структур; возможность прямого детектирования модифицированных оснований.
- Минусы: более высокий уровень ошибок по сравнению с NGS.
Ниже подготовили сравнительную таблицу методов.
| Метод | Длина прочтения | Скорость | Стоимость | Основное применение |
|---|---|---|---|---|
| Сэнгера | Высокая (до 1000 п. н.) | Низкая | Высокая | Валидация данных NGS, анализ отдельных генов |
| NGS | Низкая (50–300 п. н.) | Очень высокая | Очень низкая | Полногеномное секвенирование, экзомное, транскриптомика |
| Третье поколение | Очень высокая (до 100 000 п. н.) | Высокая | Средняя/Высокая | Сборка геномов, анализ эпигенетики |
История открытия и развития секвенирования
История секвенирования — это история технологической революции, сделавшей геном человека доступным для чтения.
- 1977 год: Фредерик Сэнгер разрабатывает метод «обрыва цепи» (метод Сэнгера), за что позже получает свою вторую Нобелевскую премию. Практически одновременно Уолтер Гилберт и Аллан Максам предлагают свой химический метод.
- 1980-е годы ― автоматизация метода Сэнгера с использованием флуоресцентных меток и капиллярного электрофореза. Это позволило начать масштабные проекты.
- 1990 год: начало международного проекта «Геном человека», целью которого было полное секвенирование генома человека. Основным методом был выбран метод Сэнгера.
- 2001 год: публикация первого чернового набора последовательности генома человека.
- 2005 год: появление первых коммерческих платформ высокопроизводительного секвенирования (NGS), таких как 454 Sequencing и Illumina (Solexa).
- 2010-е годы: стоимость секвенирования генома человека падает с сотен миллионов долларов до тысячи и ниже. Активное развитие и внедрение технологий третьего поколения.
- Наши дни: секвенирование становится рутинным инструментом в клинической диагностике, эпидемиологии и биологических исследованиях.
