Токсин ProTx‑I содержится в яде перуанского зеленого бархатного тарантула Thrixopelma pruriens. Он умеет блокировать ионные каналы, участвующие в передаче болевых сигналов, — а значит, потенциально поможет в борьбе с болью и неврологическими воспалениями. Новое исследование ученых Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН и МФТИ с коллегами из других научных центров России и Китая сравнило методы наработки ProTx-I в бактериях E. coli. Результаты опубликованы в Acta Naturae.
Биомолекулы из малоисследованных живых организмов все чаще служат основой новых лекарств. Особенно интересны яды пауков — они содержат множество активных молекул, влияющих на нервную и другие системы организма.
Среди паучьих токсинов выделяются ноттины — небольшие пептиды (20−50 аминокислотных остатков) со стабильной структурой. Они избирательно воздействуют на клеточные мембраны и рецепторы, устойчивы к нагреванию и химическому воздействию, а еще не разрушаются ферментами в организме. Благодаря этому ноттины долго циркулируют в крови и оказывают биологическое действие. В новой работе ученые изучили один из таких токсинов — ProTx‑I.
ProTx‑I и похожие соединения могут стать основой анальгетиков нового поколения: они воздействуют на ионные каналы (NaV1.7, NaV1.8, TRPA1), участвующие в передаче болевых сигналов. Изучив, как токсины взаимодействуют с этими каналами, ученые смогут разработать препараты против боли и неврологических воспалений.
ProTx‑I — пептид из 35 аминокислотных остатков. Его молекулу стабилизируют дисульфидные мостики (связи между аминокислотами с серой), формирующие ингибиторный цистиновый узел. Воспроизвести такую структуру искусственно непросто, но это критически важно: без этого нельзя изучить свойства молекулы и наладить промышленное производство лекарства на ее основе.
Ученые искали способ эффективно получать токсин ProTx‑I с помощью трансгенных бактерий E. coli. Сначала они попытались синтезировать пептид в цитоплазме бактерии — в составе слитых белков с тиоредоксином и глутатион‑S‑трансферазой. Но из‑за этого структура ProTx‑I нарушалась.
Тогда исследователи нашли два рабочих решения. Одно из них — прямая экспрессия белка в цитоплазме в составе телец включения: это нерастворимые агрегаты молекул, которые образуются в бактериях при выработке чужеродных белков. После этого молекулы нужно «привести в порядок» — ренатурировать, чтобы вернуть нужную форму.
Есть еще один успешный метод получения токсина: ProTx‑I сливают с белком, связывающим мальтозу, и секретируют в периплазматическое пространство бактерии — «внешний отсек» между ее цитоплазматической и внешней мембранами.
Активность полученного токсина проверили на ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus laevis — это модельные клетки для изучения ионных каналов и рецепторов: их состояние можно отследить по изменениям тока через мембрану. В клетки ввели гены каналов TRPA1 (хемочувствительных, отвечающих на химические сигналы) человека и крысы — они важны для терапии боли и неврологических воспалений.
Результаты показали, что человеческие рецепторы в 3 раза менее чувствительны к токсину, чем крысиные, различия связаны с изменениями в аминокислотной последовательности внеклеточных петель канала TRPA1 (S1‑S2 и S3‑S4) — именно там токсин связывается с каналом, а добавление одной лишней аминокислоты (метионина) в N‑концевую часть белка заметно снижает активность токсина.
Мы разработали эффективную систему бактериальной продукции токсина ProTx-I, и это открывает широкие перспективы для изучения того, как токсин влияет на функционирование канала. Например, полученные образцы сразу помогли нам выявить интересные особенности токсина. Изучая его влияние на ионные токи через мембраны ооцитов Xenopus, экспрессирующих каналы TRPA1 крысы и человека, мы выявили критическую роль N-концевого участка для функциональности токсина.
Ранее Наука Mail рассказывала о том, что в Перми нашли способ лечить онкологию и инфекцию одной таблеткой.
